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세포 배양 및 샘플 제제는 앞서 설명한 바와 같이 수행되었다(Engel et al., 2015). 클라미도모나스 reinhardtii 변형 매트3-4 (유멘과 Goodenough, 2001), 유리화를 돕는 작은 세포 크기를 특징으로, 클라미도모나스 자원 센터 (미네소타 대학)에서 인수하고 일정한 빛으로 성장 (~ 90 μmol 광자 m−2 s−1) 트리스 에세테이트 -에이세테 -에이프 – 포테에서 정상 대기 폭기(2001). 플런지-동결 및 저온 중심의 이온 빔 밀링은 앞서 설명한 바와 같이 수행되었다(Schaffer et al., 2017). 세포는 탄소 코팅 된 200 메쉬 구리 그리드 (Quantifoil Micro Tools)에 블러블되었고, 이는 비트 로봇 마크 4 (FEI)를 사용하여 액체 에탄 프로판 혼합물로 급락시켰다. 냉동 그리드는 개조된 오토그리드(FEI)에 장착하고 Scios(FEI) 또는 퀀타 3D FEG(FEI) FIB/SEM 현미경으로 로드되었습니다. 시료는 내부 가스 주입 시스템(GIS, FEI)을 사용하여 유기금속 백금의 얇은 층으로 코팅하였다. 셀룰러 내부를 포함하는 얇은 라멜라를 30 kV에서 Ga+ 빔과 8°-12°의 얕은 각도를 사용하여 분쇄하였다. . 초기 참조를 생성하기 위해, 우리는 완전히 라멜라 내에 내장 된 64 소포와 늦은 싹을 선택, 평균에 가까운 직경을 가지고 육안 검사에 의해 판단으로 광범위한 코트를했다. 이 세트는 두 개의 독립적인 반쪽으로 분할되어 별도로 처리되었습니다. 서브토모그램은 13.68 Å. 13.68 Å. 정렬의 첫 번째 라운드에 대한 초기 매끄러운 참조 평균을 가진 두 번 비닝 된 볼륨에서 추출하였고, 서브토모그램은 할당된 오일러 각도에 기초하여 생성되었고, 서브토모그램은 이전 라운드의 결과를 참조로 사용하여 반복적으로 정렬되었다.

수렴 후 두 독립 평균모두 서로 다른 위치에서 동일한 3배 대칭 피쳐를 포함했습니다. 이 피쳐는 참조의 중심으로 가져왔고 추가정렬은 3배 대칭적용으로 수행되었다(도 2-도 서보충 2A). 구조를 중심으로 삼중 대칭을 적용한 후, 두 참조는 동일하게 보였고 시험관내에서 얻어진 COPI 코트의 구조와 유사하였다(도 2-도 서보충 2A). 그런 다음 두 구조를 동일한 방향으로 회전하고 전체 데이터 집합의 정렬을 위한 시작 참조로 사용했습니다. 세포 구획 사이 vesicular 수송은 진핵 세포의 기본적인 기계장치입니다. 3개의 보존된, 고풍스러운 단백질 코트, COPI, COPII 및 클라트린, 내분비 통로에 있는 소포의 형성 그리고 인신 매매를 중재합니다 (Bonifacino 및 Glick, 2004). 이 외투는 조직및 기능적 원리를 공유하며, 마지막 공통진핵조상이전에 조상의 외투에서 갈라졌을 가능성이 높습니다. . (A-C) 셀 내에서 결정된 트라이어드 밀도 맵의 등표면 뷰입니다. (A) 세포질 측에서 의한 뷰, 파선 사각형은 패널 C.에 도시된 단면의 위치를 나타낸다. (c) 횡단면도, α-COP(진한 청색 화살촉) 및 β`-COP(연한 파란색 화살촉)의 N-말단 β-프로펠러의 위치에 상대적인 화물 밀도(검정 화살촉)의 위치를 나타낸다.

(D) 소포 및 싹에 코트 배열의 예. 각 행에서 왼쪽: 토모그래피 슬라이스; 중간: 각 트라이어드의 위치와 방향에서 삼각형으로 중첩된 단층 촬영 슬라이스(삼각형과 구조 간의 대응은 아래에 설명되어 있음), 패널 A-C의 구조와 유사성에 의해 착색됨(녹색에서 빨간색 = 높음에서 낮은 상관 관계); 오른쪽: 신진 흉터를 뷰어쪽으로 향하도록 회전된 트라이어드 배열의 보기입니다.